(1.中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南安阳 455000；2.周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室，河南周口 466000

0 引言

棉花既是主要的纤维经济作物，也是仅次于大豆的重要油料和蛋白质作物，在中国常年种植面积达到530万hm2。而黄萎病菌侵染以及干旱和高盐等环境胁迫严重影响着棉花的生长发育和产量的提高。为了提高棉花抗黄萎病和抗旱、抗盐的能力，人们开始利用分子生物学的方法，从棉花中分离抗逆相关的基因，尝试利用分子生物学的方法来改良棉花抗逆品种。在植物抗逆研究中，转录因子在调控植物生长发育及对外界环境胁迫的响应方面起着重要的作用。转录因子由于本身具有的调控功能而成为人们研究的对象。近年来，人们分离了一系列的植物转录因子，乙烯应答因子ERF(ethylene responsive factor)便是其中一类。ERF基因在不同植物体内过表达以后，能够在转录水平和转录后水平参与植物逆境信号传导、生物胁迫应答，从而很好地增强植物适应环境胁迫的能力。ERF亚族转录因子含有一个保守的AP2/REBP结构域，通过结合GCC顺式元件来调控下游病程相关基因的表达，同时也可以参与植物的非生物胁迫应答。棉花中ERF亚族的基因在抗逆方面也逐步显现出一定的作用。Qin等研究发现，抗病品种海岛棉(Gossypium barbadense)712GbERF在植株的根和叶中组成型表达，受外源激素刺激以及黄萎病侵染时，GbERF基因短时大量积累，受到高盐、低温、干旱和ABA处理时少量积累。他们的研究表明，该基因可能在植物乙烯、ABA、环境胁迫以及病原菌攻击响应中起着关键作用。接下来，Oin等将GbERF在烟草中过表达在未改变烟草生长表型的状况下，改变了烟草下游病程相关基因的表达，并且增加了对致病菌假单胞菌的抵抗能力。Duan等从陆地棉(Gossypium birsutum L.)中分离到GhEREB2、GhEREB3。孟宪鹏从海岛棉中分离到的GbEREBl、GbEREB2，刘坤等从海岛棉中分离到的GbEREB5,、GbEREB6在棉花生物胁迫信号传导途径中起到正向调控作用。Zuo等研究指出GbERF2在烟草中过表达可以增强过表达植株抗褐斑病的能力。Oiao等发现属于B-3亚组的陆地棉GhERF1，Jin等分离到的GhERF4、GhERF2、GhERF3、GhERF6等在棉花响应环境压力的过程中均起着重要作用。由此发现，前人对棉花ERF抗逆功能的研究逐步增多，而本研究综述了近年来自不同植物ERF转录因子的分子生物学功能的研究进展，以及ERF转录因子基因在不同植物逆境应答中不同作用的研究，但大多研究仅停留在模式生物，棉花该亚族基因的研究也仅仅处于棉花野生型或者转入模式生物进行探索，很少有在棉花中转基因的研究。因此，将来可以尝试将不同来源、研究较为清楚、能够提高植物抗逆能力的基因转入棉花进行研究。笔者从分子生物学的角度对ERF的作用及作用机制进行了总结，以期ERF在不同植物抗逆应用的研究为棉花抗逆育种和品种改良提供新思路。

1 ERF转录因子

1.1 ERF转录因子结构

ERF转录因子最早是从烟草中与PR(pathogenesis-related)基因启动子中顺式作用元件GCC盒的结合蛋白分离得到的，包含一个保守的AP2/EREBP结合域、转录调控区、碱性的核定位信号区和寡聚化位点等。其中，AP2/EREBP结构域由60个左右的保守氨基酸残基组成，第14位的丙氨酸和第19位的天冬氨酸对转录因子与顺式元件的结合及功能的行使发挥着重要作用。转录调控区是一段具有调控功能的保守氨基酸序列，分为转录激活区和转录抑制区两类，它们具有不同的调控功能。该区域的酸性氨基酸或者羧基端的EAR基序是转录因子作用的发挥必需组件。

l.2 ERF转录因子分类

Sakuma等根据DNA结合域的数目和相似性将AP2/ERF转录因子分为五大亚族：AP2(APETALA2)，RAV(related to ABI3/VPl),DREB(脱水应答元件结合蛋白)，ERF(乙烯应答因子)和其他。同时，它根据ERF结构域编码蛋白中保守氨基酸的相似性，将ERF亚族分至B组，将B组进一步分为B-1到B-6 6个亚组。而在此基础上，Nakano等根据保守氨基酸序列残基对拟南芥该家族成员进行了分类，将其分为12个小组，其中，第Ⅵ、V、Ⅵ-L、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、X和Xb-L组分别可以归至ERF亚族B-5、B-6、B-6、B-2、B-1、B-3、B-3，-4和B-6亚组，同时它根据保守区域的特点对ERF转录因子基因的功能进行了功能分析。

1.3 ERF转录因子功能

ERF转录因子在调控植物发育和逆境应答的不同过程中表现出一定功能，在诸如植物生长和繁殖发育、细胞分化，非生物和生物胁迫应答，以及植物激素信号传导过程中均起到了一定的作用。

l.4 ERF转录因子与信号转导途径

ERF受到多种信号分子的诱导，棉花等多种高等植物受到黄萎病菌侵染时会引发应激反应而产生诸如乙烯和水杨酸等多种小分子物质，从而发挥信号分子抵御病原体侵害的作用。乙烯信号转导途径中，该蛋白可以直接与ERF上游的PERE(previously identified ethylene-response element)组件结合，从而启动下游基因的表达，ERF1以级联放大的方式激活下游基因，从而在乙烯信号转导和逆境应答反应中发挥调控作用。

ERF转录因子参与逆境应答表现出多样性、复杂性和表达模式的灵活性。除受到乙烯信号分子的调控，一些ERF基因的激活也受到ABA的调控。尽管ABA途径和茉莉酸/乙烯信号途径之间存在着拮抗作用，但是，植物体可以通过非生物胁追与生物胁迫应答之间的信号对话实现植物体对环境应答的精准调控。ERF基因编码具有多种功能的转录因子，通过与不同激素的交叉对话以及信号级联反应，对不同的信号转导途径进行整合，从而在植物非生物胁迫和生物胁迫中发挥着双重作用。这为棉花对黄萎病菌等真菌的防卫应答以及抗旱、抗盐育种的研究提供了分子生物学证据。

2 ERF逆境应答及在棉花中应用潜力分析

2.1 ERF在植物防卫应答中的作用

近年来，人们对来自不同植物的ERF转录因子基因在生物胁迫应答中进行了广泛的研究。比如，将来自烟草的Tsi1基因转入烟草，可以同时提高烟草抗病原体侵害的能力。拟南芥ERF亚族ERFl和烟草的Pfi4分别提高了对坏死型真菌和细菌以及活体真菌的抵抗能力。借助芯片技术和转录组测序的发展，研究人员从许多植物中克隆了不同的ERF转录因子基因，并对它们在植物防卫应答中的作用进行了研究，见表1略。

2.2 ERF在棉花黄萎病防卫应答中作用

棉花抗病的研究主要包括细胞结构抗病性和诱导性抗病性。后者是在病原菌的诱导下，引发一系列如β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等PR(pathogen-responsived)类基因的表达。这些基因能够水解真菌细胞壁中的几丁质和葡聚糖；还有一些PR蛋白是蛋白酶的抑制剂，能抑制病原物中蛋白的合成。这些PR蛋白都可以抑制真菌的生长，从而在棉花对黄萎病的防卫反应中起到了重要作用。

近些年的研究发现，棉花中的ERF转录因子在受到黄萎病菌侵染时，也可以诱导上述2种病程相关基因的上下调表达，从一定程度上提高植物对病原菌的抵抗能力。如Duan等从海岛棉中筛选出ERF类转录因子EREBP2/3，证实它们受乙烯和茉莉酸的诱导。这2个ERF类转录因子可以和GCC-box特异性结合，在抗病中发挥了重要作用。Zuo等在黄萎病菌侵染后的海岛棉中分离到了GbERF1/2基因，并发现其在受到黄萎病菌侵染后表达量会明显提高；将其在烟草中超表达后，病程相关蛋白基因PR-1b,PR2a和PR4等的表达量明显增加，提高了烟草对一些真菌病害的抵抗能力。Qin等在海岛棉(Gossypium barbadense)GbERF及陆地棉(GosSypium hirsutum L.)ERF中均表现出了病原菌诱导下，下游病程相关基因的表达量增高。孟宪鹏克隆到海岛棉GbEREB1，GbEREB2基因并第1次将2个基因分别转入棉花，并发现转基因棉花在黄萎病诱导下病程相关基因的表达。

在病原体侵染所引起的乙烯生物合成系统中相关基因启动子的功能分析显示：受病原体侵染产生的乙烯诱导表达PR基因的启动子区普遍发现作为乙烯应答元件GCC-box(AGCCGCC)的存在。因此，可以利用ERF转录因子基因可以激活下游启动子中含有GCC-box的PR基因表达的特性，对棉花进行黄萎病抗性改良。

2.3 ERF转录因子在非生物逆境应答中作用

随着植物ERF基因抗逆功能的发现以及许多转基因工作的开展，人们发现ERF在抗逆育种中具有一定的应用潜力，如表2略所示。Park等将Tsi11基因转入烟草中可以提高抗渗透胁迫的能力；Guo等将OPBP1基因转入番茄也可以提高转基因植株的耐盐能力；Zhang等将GmERF3转入烟草也同时提高了抗多种非生物胁迫能力。此外，也有学者在水稻和番茄中将ERF基因过表达后的转基因植株均表现出了抗旱或耐盐能力不同程度的提高。Oh等在水稻中过表达AP37基因，转基因植株在生殖生长时期表现出了耐干旱和耐盐能力的提高。转基因植株未出现不期望的生长表型，并且在田间干旱条件下，转基因植株比野生型植株更加耐旱，比野生型植株谷物产量高出16%～57%。Perata等在水稻中过表达Sub1A-1增强了转基因水稻的耐深水胁迫能力。由此看来，ERF基因作用广泛，可以参与不同过程一系列基因的表达。

棉花生产季节相对较长，易受到低温、干旱、涝渍和盐渍等非生物逆境的影响，在干旱和盐渍逆境下，植物为抵抗渗透胁迫，通常在细胞内积累两类性质不同的渗透保护剂。一类是小分子有机物质，如甘露醇、甜菜碱和脯氨酸；另一类是蛋白质，如渗透蛋白。因此，分离能够合成渗透调节物质的基因并将其转入棉花，不失为提高棉花对各种诱导渗透胁迫的逆境适应性的措施之一。虽然在目前的抗旱基因研究中，已克隆到一些可以合成小分子渗透物质的基因，如亚洲棉(Gossypium.arboreum L.)GaP5CS(Pyrroline-5-carboxyate synthetas)，GaTPS(trehalose-6-p synthase)，但抗旱效果还不够明显。随着ERF转录因子基因在不同植物逆境应答中的研究，人们发现该转录因子在棉花的非生物胁迫应答中也起着重要作用。例如，陆地棉ERF亚组的GhERF4、GhERF2、GhERF3、GhERF6和GhERF1响应盐、低温和干旱胁迫及乙烯和ABA处理，在一定程度上提高非生物逆境抗性。但目前棉花转化周期较长，大多棉花ERF转录因子基因现在仅处于基因克隆、体外功能鉴定和在模式生物中进行功能鉴定上，棉花ERF参与抗逆的机理还需进一步研究。

鉴于ERF基因在许多植物逆境应答机制的研究越来越清晰，并且有些ERF基因的过表达植株与野生型相比，并未出现诸如矮化或者产量降低等不希望的表型。尽管棉花中该亚族抗非生物逆境胁迫的研究和报道较少，但可以尝试将其他植物中功能研究较清楚的ERF基因，诸如SublA-1,AP37等转入棉花，并观察其是否类似水稻那样，在棉花中同样起到提高耐涝渍能力。

3 ERF转录因子逆境应答机制

转录调控和转录后调控在植物细胞适应外界环境变化方面均起到了重要作用。信号转导及目的基因的调控涉及复杂的信号网络。Golldack等指出，调控过程的灵活性和转录后修饰决定了环境适应中转录因子的功能特异性。一方面，通过信号途径中ERF亚族转录因子基因可以调控下游基因的应答；另一方面，该亚族转录因子的表达也受到防卫反应相关的植物激素如乙烯、茉莉酸和水杨酸的调控。

3.1 转录水平的调控

ERF转录因子通过与病程相关基因启动子中的GCC-box(GCCGCC)的结合直接调控病程相关基因，诸如prb-1b(PR1)，β-l，3-葡聚糖酶(PR2)，几丁质酶(PR3)和osmotin(PR5)的表达。一些ERF蛋白在体外也可以与除GCC-box之外的DRE/CRT干旱应答顺式元件结合。另外，在苜蓿中，ERN(ERF节间生长所需)可以与NF-box特异融合。Goudack、Lee等研究显示，拟南芥ERF亚族B-3亚组的基因，还可以与ABA耦合元件CE(coupling element)l结合。因此，ERF基因通过与不同顺式元件结合从而在转录水平上参与各种逆境胁迫应答。此外，Golldack等研究表明，DNA甲基化和组蛋白的转录修饰等对逆境应答基因的表达也有很大的影响。

3.2 转录后修饰与调控

ERF转录因子在行使抗逆功能的过程中可能存在着诸如磷酸化等的转录后修饰与调控作用。拟南芥第Xb组和第Xb-L组中，N末端区域都有1个保守的元件，该元件富含半胱氨酸，可能是一个锌指蛋白元件，可能与结合DNA或者在蛋白互作中起作用。第Ⅵ、Ⅶ、Ⅸb组中的一些保守元件可能足磷酸化位点，这些功能位点可能是有丝分裂原激活蛋白(MAP)或者酪蛋白激酶I，磷酸化第Ⅵ组中的保守元件Ⅵ-3/sp(T/V)SVL。并且该保守元件在多种蛋白，比如MYB-Like蛋白中是保守的。有丝分裂原激酶磷酸化位点在第Ⅶ、Ⅸb组蛋白中也是保守的由此可见，ERF结构域中有着潜在的磷酸化位点，它们对ERF抗逆功能的发挥有着一定的修饰和调控作用。

除此之外Golldack、Zhang等认为，一些受微小RNA介导的转录后沉默和活性氧物质的信号调节对逆境应答基因的表达也有很大的影响。植物的信号转导和对逆境的应答，是一个完整的调控网络，各途径之间常有交叉对话，转录后修饰和调控对ERF行使其抗逆功能是很重要的。

4 展望

棉花的生长和产量的提高很大程度上受到黄萎病菌侵染和干旱、盐碱、低温等非生物逆境的影响。国内外多家科研机构都在积极寻找棉花抗逆品种改良的方法，其中更多地将希望寄托于转基因改良。随着ERF转录因子在小麦、大麦、大豆、水稻和番茄中研究的深入，发现ERF亚族转录因子在棉花抗逆品种改良中也有着一定的作用，但是它在实践中应用的研究还很少。从基础研究到棉花抗逆育种选育，研究者们还需要做很多工作。

基于当前棉花抗逆育种的研究以及ERF亚族在植物逆境应答中应用的研究，建议未来从3个方面来研究ERF亚族在棉花抗逆品种改良中的作用：(1)尝试将不同来源、机制研究较为清楚、效果明显的ERF亚族基因转入棉花，以提高其抵御黄萎病等不同病原菌诱导下病程相关基因的表达和非生物胁迫应答基因的表达，从而获得具有较好抗逆性状改良的棉花品种；(2)利用反向遗传学的策略继续从棉花基因组中分离ERF亚族的基因并在模式生物和棉花中鉴定抗逆相应基因的功能；(3)对ERF转录因子基因的启动子中顺式元件进行分析，以期更好地理解ERF转录因子基因在植物逆境信号转导中的位置和作用，并从中获得一些时空特异表达的启动子，避免生物体在转基因后代中过表达造成能量浪费及不希望的表型的出现，从而更好地培育抗多重逆境的棉花品种。

注明：国家杰出青年基金项目(31125020)。