(1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，济南250353；2.山东省农科院畜牧兽医研究所/山东省动物疫病防控与繁育重点实验室，济南 250100)

0 引言

转基因可食疫苗是通过基因工程技术把病原微生物的保护性抗原基因转入植物的表达载体中，利用植物生物反应器生产的可食用的基因工程疫苗。人或动物摄取转基因植物中的抗原递呈到肠道相关淋巴组织，被其表面特异受体特别是M细胞识别，产生黏膜和全身免疫应答，使机体获得特异抗病力。

转基因可食疫苗与传统疫苗相比具有诸多优点：(1)免疫接种方便。通过摄食免疫，避免了注射免疫引起的疼痛、不适，解决了儿童和家畜接种的难题，降低了注射环节带来的污染和注射费用；(2)既能引起粘膜免疫反应，也能引起全身免疫反应。可食疫苗能在免疫早期即可诱导局部粘膜产生分泌性IgA，诱导粘膜细胞毒性T淋巴细胞反应，产生分泌IFN-γ和CD4+细胞，利于预防和清除呼吸系统、消化系统病原体的侵入；(3)安全。转基因可食疫苗只表达保护性抗原基因，不含致病微生物或致病因子，对人畜安全；(4)可直接食用，免去了复杂昂贵的蛋白质提纯过程和工艺，减少了重组蛋白在纯化过程中质量和数量上的损失。

转基因可食疫苗的应用前景广阔，自1990年诞生以来一直是全球生物制品研究人员关注的热点。目前转基因可食疫苗还处于试验阶段，但有理由相信随着转基因技术的日臻完善，转基因可食疫苗商品化指日可待。

1 植物细胞表达系统的优点

植物生物反应器是一个安全和廉价的疫苗生产体系，具有许多潜在的优势：(1)生产简单、生产成本低廉，容易大量生产制造。植物细胞具有全能性，能够再生植株，转基因植物的种植不需要特殊技术和复杂的生产设备以及设施，只需阳光、养分和水就可大面积栽培，是经济有效的疫苗生产系统；(2)植物细胞遗传转化技术成熟，组织培养容易，表达系统利于重组蛋白的正确装配和表达，其产物具有免疫原性和生物活性；(3)安全性好。转基因植物疫苗只表达抗原基因，无致病性。植物不带有与人类共患的传染病害，是安全、卫生的生物反应器和绿色工厂。转基因植物疫苗在大规模生产过程中，不易被微生物污染。转基因植物疫苗在生产、免疫过程中对人、动物、环境无危害、无污染，相反疫苗生产过程绿化、美化环境；(4)稳定性好：转基因植物疫苗可稳定表达重组抗原。植物细胞的细胞壁起到天然的生物胶囊作用，植物疫苗口服后不易被胃内的酶破坏。储运方便，室温保存，不需低温保存和冷链运输；(5)植物表达载体中串联表达多种外源基因，进而能生产多联、多价口服疫苗。

2 转基因可食疫苗的研究策略

转基因植物可食疫苗生产的流程包括：克隆保护性抗原基因一植物表达载体的构建—含抗原基因的表达载体导入植物细胞—植株再生—转基因植株获得一外源基因表达稳定性、安全性、免疫原性测定。

2.1 受体植物的选择

转基因可食疫苗的受体植物要具备易于遗传转化、基因序列已知、植物再生容易、种植区域广泛及不易腐烂等特点。目前国内外已有100多种外源蛋白在食品(或饲料)植物的叶子、块茎、种子、果实中成功表达。烟草、马铃薯、番茄等被广泛用于研制植物疫苗。水果和蔬菜是转基因植物疫苗的理想受体植物。

烟草因再生和转基因技术的成熟成为生产重组蛋白的模式植物，第一个转基因植物疫苗就是用烟草作为受体。但烟草不适于作为疫苗直接食用，烟草中的尼古丁等生物碱限制了其应用。

农作物易于贮存、运输、室温稳定，具有较低的过敏原性，是适宜的可食疫苗表达受体。豆科植物(如大豆、花生、苜蓿等)种植广泛、蛋白含量高、具有固氮作用，生产成本低。玉米、水稻、小麦和大麦等谷物种植区域广，种子在常温下能够长期储存，尤其玉米是多种畜禽饲料的主料，是理想的畜禽可食疫苗表达受体。

水果和蔬菜能够生食、适口性好、易消化、常年可供应、具有独特优势，成为转基因植物疫苗研究的热点。莴苣生长快，可以直接食用，是较好的实验研究对象。番茄、香蕉是人用疫苗实用的传递系统。已报道的果蔬类转基因植物疫苗载体有香蕉、番茄、樱桃、草莓、马铃薯、甜瓜、胡萝卜、山芋、芋头、蘑菇、芦荟、莴苣、菠菜和浮萍、单细胞藻类等。

2.2 转基因可食疫苗的表达系统

目前生产转基因植物可食疫苗主要有稳定的整合表达系统和瞬时表达系统。

2.2.1 稳定的整合表达系统

保护性抗原基因通过农杆菌或基因枪介导插入到植物的核基因组或叶绿体基因组中获得能稳定表达的转基因植株，性状可遗传给子代，形成表达疫苗的新植物品系。可插入的外源基因大小可达50kh。目前研究成功的植物疫苗主要使用该系统产生的蛋白具有免疫原性。

2.2.2 瞬时表达系统

瞬时表达系统不能克服基因渗漏和重组蛋白需要纯化等缺点。瞬时表达系统又分为病毒载体介导和农杆菌渗透法介导两种。病毒载体介导的瞬时表达系统是将抗原基因插入到植物病毒载体基因组中，再用重组病毒感染植物，抗原基因随病毒在植物体内复制、装配而得以高效表达，外源基因不整合到植物基因组，只在感染的细胞内瞬时表达，因此每个寄主植株都要接种病毒载体。与稳定表达系统相比，植物病毒介导的瞬时表达系统的抗原表达水平高，但插入的外源基因片段大小受严格限制，转化系统必须限制在特定的环境(如温室)中。接种病毒后1～2周内高水平的表达外源蛋白(2g/kg植物组织)使他成为具有吸引力的疫苗生产系统。农杆菌渗透法介导的瞬时表达系统简便易行，可对重组蛋白的表达载体的遗传构建作初步快速评估，逐步成为外源蛋白表达的平台。德国IconGenetic公司将农杆菌渗透法和病毒载体转化法结合，建立了快速大规模制备抗原的Magnifection技术体系。

与瞬时表达系统相比，稳定的整合表达系统的优点：(1)容易获得大量转基因株系，遗传性状能稳定传递给子代；(2)表达抗原可不经纯化直接口服免疫，大大降低了纯化的成本；(3)多个外源基因可同时表达，获得多抗原复合疫苗。缺点：(1)植株再生和纯合所需时间长；(2)蛋白表达和积累不可预测；(3)部分植物对该转化方法不敏感；(4)抗原蛋白表达含量低。

2.3 提高转基因可食疫苗中抗原表达水平的策略

转基因植物可食疫苗中抗原蛋白表达水平较低，抗原在植物中表达量大多数占总可溶蛋白0.01%～0.4%。要使植物疫苗达到有效的免疫作用，首先要提高抗原的表达量，合理设计基因表达的各个环节。

2.3.l 修饰、优化抗原基因

(1)选择强启动子。植物疫苗的启动子分为植物组成型、组织特异性和可诱导性启动子3种，不同的启动子在不同的转基因植物中表达效率差异较大。双子叶植物选用35S启动子表达效率高，而单子叶植物用Actin、Ubiquitin等启动子表达效率高。Mason表达载体的CAMV35S启动子与烟草刻蚀病毒5’末端重复序列相连作为HBsAg基因的启动子，使外源基因表达量提高了11倍。(2)优化抗原密码子，根据密码子兼并性选择植物偏爱的密码子。优化密码子后，LTB在马铃薯块茎中的表达量提高了5～40倍。(3)选择合适的抗原基因编码序列，选择适宜在植物中表达的A+T组成等。(4)表达多顺反子mRNA，以避免基因沉默。

2.3.2 加工过程调控和增强翻译

转录后的加工过程如5’端加帽、mRNA前体剪接及3’端poly A都会影响基因在植物细胞中的表达。Richter等发现vsp和马铃薯蛋白酶抑制剂2的polyA信号能促进HBsAg在植物中的积累，表达水平比。nos终止子提高了几倍。优化引发位点和Kozak序列可以增强翻译的启动。翻译启动后，缺少合适的tRNA会限制翻译速度。

2.3.3 叶绿体转化

传统的遗传转化建立在植物核基因组上，新近的靶向表达策略将抗原基因整合进入叶绿体基因组，抗原在叶绿体中合成、累积。叶绿体表达系统具有很多优点：(1)外源基因整合入叶绿体基因组的spacer区，消除基因表达的不稳定性和基因沉默；(2)植物细胞叶绿体DNA分子多达10000个拷贝，抗原表达量大幅度提高，研究表明转基因烟草叶绿体中CT-B表达量是核基因组的410倍；(3)可插入大片段或多个基因；(4)叶绿体转化的植物花粉中不表达重组蛋白，避免了花粉介导的基因泄露和污染。但是叶绿体表达的蛋白不能进行翻译后修饰，只能表达不需糖基化的蛋白。叶绿体转化目前还局限于烟草。目前叶绿体中成功表达了SARSV、犬细小病毒、大肠杆菌、ItlV、轮状病毒等抗原基因。

3 转基因可食疫苗的研究现状

1990年Curtiss和Cardineau最早研制成功转基因植物疫苗。随后，表达各种致病微生物抗原基因的转基因植物疫苗不断涌现。

3.1 人用转基因可食疫苗

第1个转基因植物疫苗是在烟草中表达链球菌变异株(Streptococcus mutans)表面抗原A(spaA)，重组蛋白的表达量占烟草叶子中可溶性蛋白总量的0.02%，用转基因烟草饲喂小鼠可诱导粘膜免疫反应即产生抗体。至今报道人用转基因植物生产的疫苗有数十种。人用转基因植物疫苗研究主要针对人类感染广泛的HIV、乙肝病毒、霍乱苗、Escherichia coli、rotavirus等病原。乙肝病毒造成全球约3.5亿人感染，是依赖疫苗预防的主要传染病原，目前已在烟草、莴苣、番茄、马铃薯、羽扇豆、香蕉等植物中成功表达HBsAg基因。霍乱毒素B亚基(CT-B)基因、大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位(LT-B)基因分别在烟草和马铃薯、玉米中表达，动物试验表明表达的抗原均能刺激产生特异性抗体应答，并产生一定的保护作用。狂犬病病毒G蛋白基因在番茄中表达量为每克可溶性蛋白不足0.001%，但能与天然糖蛋白诱导的多克隆抗体发生免疫反应。其他的报道有在菠菜中表达HlV-l tat蛋白，在烟草中表达SARS冠状病毒蛋白，在番茄中和马铃薯中表达Norwalk病毒衣壳蛋白等。

1997年，美国FDA同意大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位(LT-B)转基因疫苗的人类临床试验以来，已有3个临床试验证实植物细胞可充分保护抗原免被消化；抗原可诱导系统免疫和粘膜免疫反应；遗传修饰材料证明没有不良影响。

3.2 兽用转基因可食疫苗

转基因植物疫苗防治动物传染病具有现实意义和独特优势。2006年2月，美国农业部批准了美国Dow Agroscience公司开发的烟草表达的转基因鸡新城疫植物疫苗NEWCASTLE Concent商品化，这是第一个被许可上市的兽用转基因植物疫苗具有里程碑意义，将推动其他转基因植物疫苗的发展。

口蹄疫病毒(FMDV)抗原基因在苜蓿、烟草、番茄中表达成功。Dus Santos在苜蓿中成功表达了FMDV VPl基因的抗原表位VPl35-160肽段和GUS的融合基因，表达量占转基因苜蓿可溶性蛋白总量的0.05%～0.10%，供试小鼠激发了强烈的免疫应答，产生的特异性抗体能与VPl35-160、VPl和FMDV的完整颗粒发生特异性免疫反应。Dus Santos等将FMDV衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因融合，作为免疫原基因导入紫花苜蓿，通过肠道外途径接种小鼠，使其产生了很强的抗体应答，并能够完全抵抗强毒攻击。

传染性肠胃炎病毒(TGEV)S蛋白分别在转基因烟草、拟南介、马铃薯块茎和玉米种子中得到表达，植物疫苗口服或注射免疫老鼠均具有免疫原性，转基因烟草蛋白粗提物肌肉注射免疫仔猪能检测到特异性抗体。猪流行性腹泻(PEDV)中和表位基因整合到烟草、马铃薯中，重组蛋白口服免疫老鼠也能产生特异抗体。只感染猪的产肠毒素大肠杆菌（ETEC)F4菌毛也在烟草、苜蓿和大麦中表达获得亚单位疫苗具有免疫原性，口服免疫仔猪后具有免疫保护作用。

Chia等在烟草叶子中成功表达蓝耳病病毒GP5蛋白，表达量为0.011%，用转基因烟草叶子50g捣碎后饲喂6周龄健康猪，4次后血清中蓝耳病病毒抗体达l:4～l:8。

转基因马铃薯抗支气管炎病毒(IBV)S糖蛋白疫苗口服灌喂14日龄小鸡，给药3次后能产生特异抗体，且能抵御IBV强毒的攻击。转基因拟南介抗鸡传染性法氏囊病病毒VPl抗原蛋白粗提物口服免疫雏鸡，与注射商业化疫苗诱导的保护力相当。Huang等将禽呼肠孤病毒小核心蛋白基因分别与CaMV35S启动子和Actl启动子连接，构建表达载体，并转化紫花苜蓿，表达量分别为0.008%和0.007%。还有在玉米中表达新城疫病毒融合蛋白，在马铃薯中表达新城疫病毒血凝素蛋白基因，在大麦、蘑菇中表达了甲型流感病毒血凝素的报道。

4 转基因可食疫苗存在的问题及展望

利用植物表达系统生产疫苗的策略是可行的，但目前还存在许多问题亟待解决：(1)剂量问题。转基因植物疫苗产生保护性免疫的最小剂量是多少?外源基因表达量能否在植物中累加到足够量而达到商业化生产剂量?只靠食用能否获得足够的抗原量?(2)如何突破表达量低的瓶颈?(3)获得保护性应答是否需要黏膜免疫佐剂?(4)服用转基因可食疫苗是否会诱导免疫耐受?(5)怎样控制转基因植物避免影响生物多样性?(6)如何解决口服时抗原易被消化道降解问题?(7)如何使公众接受转基因植物进入食物链?

经过近20年的研究，转基因可食疫苗取得了一些可喜的成果。从长远观点出发，转基因植物生产可食疫苗是经济的、有效的，在未来的疫苗市场上将占主导地位。相信在不久的将来植物疫苗将变为现实，进行大规模生产，并彼人们逐步接受，人、畜禽只要吃一些转基因植物就可方便获得免疫力。

注明：山东省优秀中青年科学家科研奖励基金资助（No.BS2009ny026）。