(江西农业大学农学院，南昌 330045)

0 引言

植物表皮蜡质是各种脂类化合物组成的一层疏水屏障，覆盖在陆生植物地上大部分器官的表面，是植物表面的重要结构。植物表皮蜡质组成成分复杂，不同的植物组成成分也不同，主要是由碳原子数在20～34碳之间的特长链脂肪酸及其衍生物(包括烷烃、醇、醛、脂肪酸和酯等)组成，还包括萜类和其他微量次级代谢物如固醇和类黄酮类物质。一般认为，表皮蜡质具有阻止植物非气孔性失水、维持植物表面清洁与植物表面防水、抵御病虫害、防止有害光线对植物的损伤、反射可见光、影响叶片和果实着色、防止果实开裂等生理功能，另外蜡质对植物叶片和果实的形态发育和花粉发育也有重要影响，进而影响植物的育性。

植物蜡质合成和运输是一个非常复杂的过程，需要一系列酶和编码这些酶的基因的参与。但是由于大多数参与蜡质合成和运输的酶都是膜结合蛋白，且大多以多酶复合体的形式存在，分离起来比较困难，因此目前对参与植物蜡质合成和运输途径的酶和基因的研究还不彻底，许多酶和基因都没有被鉴定出来，极大地阻碍了人们对植物蜡质合成和运输途径的理解。

近年来，研究者们采用各种先进的遗传、生化和分子生物学分析技术，对植物蜡质合成和运输途径进行了深入的研究，取得了许多进展，部分蜡质合成与运输途径的具体环节已经阐明。笔者综述了目前已经研究清楚的蜡质合成与运输途径及其调控机理，并对其中存在的问题及其研究前景进行了探讨。

1 植物蜡质合成途径

1.1 特长链脂肪酸(very long chain fatty acids，VLCFAsl合成

植物表皮蜡质前体特长链饱和脂肪酸(VLCFAs)的合合成必须分2步在表皮细胞不同的亚细胞结构中完成。

第一步是在植物表皮细胞质体中由脂肪酸合成酶复合物(fatty acid synthase complex，FAS)催化乙酰辅酶A(C2-CoA)的酰基链经过多个循环反应延伸成C16或C18酰基-ACP，再由酰基-ACP硫解酶(fatty acy1-ACP thioesterase，FAT)催化形成自由的C16或C18脂肪酸，然后由质体外膜上的长链酰基辅酶A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase，LACS)催化形成相应的酰基辅酶A，再转移到内质网上。FAS由4种可溶性酶组成，其中的β-酮酰基ACP合成酶(β-ketoacyl ACP synthase，KAS)具有一定的酰基链长度特异性：KASIII催化的酰基链长度为C2到C4，KASI(C4到C16)，KASII(C16到C18)。因此，根据FAS所含KAS酶的种类可将FAS分为3类型。

C16和C18脂肪酸的进一步延伸需要通过FAT将它们从ACP载体蛋白上释放出来，拟南芥fatb功能缺陷型突变体的茎和叶中，总蜡质含量分别降低了50%和20%，基于这个表型，研究者们发现拟南芥脂肪酰基ACP硫酯酶.B(FATB)可以催化C16酰基-ACP(和一种未知的C18化合物)裂解释放出自由的脂肪酸，从而参与植物蜡质合成过程。

脂肪酸通过硫酯酶从ACP中释放出来之后，会由质体外膜上的LACS催化形成相应的酰基辅酶A。基于被标记的脂肪酸从质体中外运的动力学研究，脂肪酰基很可能是通过一种简单的扩散作用从硫酯酶转移到LACS，但是这2种酶之间的迁移机理，目前还不清楚。目前，在拟南芥中发现了9个LACS基因，其中只有LACS2参与了表皮角质的合成。研究者们发现拟南芥LACS2突变体莲座叶上角质成分含量减少，而不是蜡质。事实上，LACS2突变体莲座叶上蜡质成分不是减少了，而是增加了。因此，究竟是哪一种LACS负责催化质体中合成的脂肪酸形成相应的酰基辅酶A，从而参与植物蜡质的生物合成还有待进一步的研究。

第二步是C16或C18脂肪酸延伸形成VLCFAs用来作为蜡质合成的直接前体物质。VLCFAs是在植物表皮细胞的内质网中由脂肪酸延伸酶(multienzyme fatty acid elongase，FAE)复合体催化形成。FAE使用丙二酰-CoA作为酰基供体。质体外的丙二酰-CoA是由乙酰辅酶A羧化酶(aeetyl-CoA carboxylase，ACCase)催化产生。在拟南芥中有2个编码ACCase的基因(ACC1和ACC2)，目前已经证明ACCl确实起到了为VLCFAs的延伸提供丙二酰-CoA的作用。在内质网中，以在质体中形成的C16或C18脂肪酸和丙二酰-CoA为底物，在FAE的催化下，经过多个循环反应，C16或C18脂肪酸底物被延伸成为具有足够碳链长度(20～34)的VLCFAs。每个循环包括4反应，分别由β-酮脂酰辅酶A合成酶(β-ketoacyl-CoA synthase，KCS)、β-酮酰基辅酶A还原酶(β-ketoacyl-CoA reductase，KCR)，β-羟酰基辅酶A水解酶(β-hydroxyacyl-CoA dehydratase，HCD)和烯酰基辅酶A还原酶(enoyl-CoA reductase，ECRl4种酶控制，其中KCS具有严格的底物特异性，它的类型决定了循环反应的速度和最终得到的酰基辅酶A产物的酰基链长度。

目前，在植物中已经发现了ELO和FAEl2种类型的KCS。在拟南芥中已经发现了4个ELO类型的KCS基因，但它们的具体功能尚未鉴定。另外，在拟南芥中也已经发现了21个FAEl类型的KCS。一个还未解决的问题是有多少种KCS参与了VLCFAs酰基的延伸过程。这是因为同一种KCS通常可以催化一系列连续的延伸步骤，而不同的KCS可以催化的VLCFAs的碳链长度有可能重叠。从拟南芥中克隆出的CUT1/CER6基因编码一种FAEl类型的KCS，CUT1/CER6是到目前为止在拟南芥中发现的唯一个专门催化碳原子数大于22的VLCFAs的酶。基因芯片分析表明，除了CUT1/CER6，还有7个KCS基因在拟南芥的茎表皮细胞中表达上调，其中包括了FIDDLEHEAD和KCS1，但是这些基因的具体功能目前还不清楚，需要进一步的研究。

最近，研究者们从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中分离出了编码KCR和ECR的基因。以酵母KCR序列为探针通过BLAST搜索在拟南芥基因组中发现了2个KCR的同源基因(AtKCR1和AtKCR2)，它们在拟南芥茎表皮中的表达量很高，并且都定位在内质网上。但是，只有AtKCR1可以使KCR功能缺失的酵母突变体的表型恢复，表明只有AtKCRl参与了VLCFAs的生物合成。

2004年，研究者们从拟南芥中鉴定出了一个单拷贝的ECR基因，该基因编码一种烯酰基辅酶A。拟南芥ECR和从拟南芥CER10突变体中克隆的CER10是同一个基因。对CER10突变体的研究表明，所有包含VLCFAs的脂质，包括表皮蜡质、种子甘油三酯和鞘酯的合成都需要CER1O/ECR的参与。但是，在拟南芥ECR功能缺失型突变体CER10中，仍然保留了野生型40%的蜡质含量以及一些用于合成种子甘油三酯和鞘酯的VLCFAs，这表明在拟南芥中或许还存在着其他的ECR，或者有其他的酶具有和ECR相似的功能。

对于FAE复合体中的最后一种酶HCD的研究目前还不多。最近，研究者们用酿酒酵母FAE脂蛋白体重建的方法发现一种定位在内质网上的跨膜蛋白 PHSlp具有脱水酶的活性。这个发现有望推动对HCD酶的研究进展。2008年，Bach等在拟南芥中发现了一个编码HCD的基因PASTICTNO2，并证明了PASTICCINO2是拟南芥表皮蜡质合成所必须的一种酶。

1.2 初级醇和蜡酯合成

由VLCFAs合成蜡质成分存在2种途径。第1种是初级醇途径(prinary alcohol pathway)，在该途径中VLCFAs被还原成初级醇。初级醇可以在蜡质合成酶/甘油二酯酰基转移酶(Wax synthase/diacylglycerol acyltransferase，WS/GAT)的催化下与饱和脂肪酸缩合形成烷基酯(alkyl esters)。该途径合成的蜡质成分酰基链长度一般为偶数，产生的蜡质成分主要是C26、C28或者是C30、C32初级醇，这些初级醇通常是以自由体的形式存在，并且可以被各种酰基化合物酯化，这些化合物包括芳香族、短链(C2)、长链(C16、C18)和特长链脂肪酸。

植物蜡质成分中的醇是由VLCFAs前体经过还原反应产生的。脂肪酸要还原成醇，应该首先还原成醛。在甘蓝中的研究结果支持脂肪酸要还原成醇需要经过连续2个还原反应，因为从甘蓝中可以分离出醛这种脂肪酸还原成醇的过程中的中间产物。玉米GL5突变体的蜡质化学成分变化起初被研究者们看作是2步还原形成醇的假说的又一证据，但是随后研究者们发现该突变体的表型变化和GL5和GL202个基因的突变有关，但是这2个基因都还没有被克隆出来，目前还不清楚是这2个基因中的1个或2个基因都编码了相关的还原酶，因此玉米蜡质中的醇生物合成途径到底是不是需要经过2步还原反应，目前尚无定论。

有一些试验结果表明，植物中的各种酰基辅酶A可以直接被还原成初级醇。最初，研究者们发现在眼虫藻(Euglena gracilis)中的酰基辅酶A可以直接被还原成醇而不会释放出中间产物醛。随后，研究者们又在加州希蒙得木胚芽和豌豆叶片中发现脂肪酰基还原酶(fatty acyl reductase，FAR)负责催化酰基辅酶A直接还原成醇。

在拟南芥中也存在着类似的参与初级醇合成的FAR，研究者们在拟南芥基因组中发现了8个编码FAR类似蛋白的基因，其中一个是CER4。拟南芥CER4突变体表皮蜡质成分中初级醇和蜡酯的成分明显减少，表明CER4编码一种和醇合成相关的FAR。

研究者们已经证明CER4所编码的酶确实是一种主要负责初级醇合成的FAR。拟南芥中的CER4可以催化从酰基前体还原成初级醇的整个过程，所以拟南芥是通过直接还原途径合成初级醇。

在高等植物、哺乳动物和细菌中，酯的合成都是由蜡质合成酶(Wax synthase，WS)催化，按照序列信息，WS可以分为3类。第1类以加州希蒙得木WS为代表，这类WS的第1个底物可以是C14到C24的饱和和非饱和的酰基辅酶A，第2个底物是非饱和的C18醇。在拟南芥中有12个与加州希蒙得木WS同源的基因序列，但是它们的功能都没有被鉴定出来。第2类以哺乳动物WS为代表，在植物中没有发现这类WS的同源序列，这类WS的第1个底物主要是C12和C16酰基辅酶A，第2个底物是碳原子数少于20的醇。第3类以乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)WS为代表，这类WS是一种双功能的蜡质合成酶/甘油二酯酰基转移酶(wax synthase/diacylglycerol acyltransferase，WS/DGAT)，它们的2个底物分别是C14和C16酰基辅酶A以及C14到C18的醇。到目前为止，在20多种微生物中发现了将近100个WS/DGAT同源序列，在拟南芥基因组中也发现了10个WS/DGAT同源序列。研究者们推测，拟南芥中的初级醇可以在WS/DGAT的催化下与饱和脂肪酸缩合形成烷基酯。最近，拟南芥的1个WS/DGAT的功能被鉴定出来，它负责拟南芥茎中表皮蜡酯的合成。这个酶的主要底物是C16酰基辅酶A，说明那些在蜡质合成途径中非常早产生的中间产物可以和醇一起通过酰基延伸和还原形成最终的蜡质成分。

1.3 烷烃、二级醇和酮的合成

第2种途径是烷烃途径(alkane pathway)，在该途径中VLCFAs在脂酰辅酶还原酶(fatty acyl-CoA reductase，FAR)的作用下还原成醛，醛由醛脱羧酶(aldehyde decarbonylase)催化进行脱羧反应生成烷烃。烷烃由中链烷烃羟化酶(mid-chain alkane hydroxylase,MAH)催化经羟化反应后生成二级醇，二级醇经过MAH催化生成酮。

烷烃途径主要负责合成具有奇数碳原子数的蜡质成分。这个途径中合成的主要蜡质成分是烷烃。有证据表明，VLCFAs前体可以用作烷烃合成的底物，这个结论首先是从多种植物的饲喂试验中得出的，这些饲喂试验最后都产生了各种蜡质成分包括烷烃、二级醇和酮。随后拟南芥的分子遗传学试验进一步确定了这个结论。在VLCFAs延伸功能缺失有关的拟南芥CER6和CER10突变体中，比VLCFAs更长的酰基链化合物的数量大幅下降，并且所有奇数碳原子数的蜡质成分(烷烃、二级醇和酮)几乎消失。综合以上试验结果，研究者们认为延伸反应优先于脱羰反应，因此初级醇途径和烷烃途径需要竞争获得酰基辅酶A前体。

虽然将VLCFAs前体转化为烷烃可以通过一步反应完成，但是无论是从理论上或者试验数据上来看，一个直接的脱羧反应都不可能实现从VLCFAs前体到烷烃的转化。目前，研究者们发现，有许多拟南芥突变体茎表皮蜡质成分中烷烃含量减少，这些突变体包括CERl，CER2，CER3，CER8，CERl9和CER22，其中有一部分突变体中导致突变的基因编码的很可能是烷烃途径中催化第一步反应的酶，但是在这些突变体中，有的基因还没有被克隆出来(CERl9,CER22)，有的虽然基因已经克隆出来了，但它们所编码的蛋白的具体功能目前还不清楚(CERl，CER2，CER3/WAX2/YRE/FLP)。

目前，有许多研究证明烷烃合成途径的中心反应，即使碳链长度从偶数向奇数转变的反应，被认为是酰基前体损失一个碳原子而不是增加一个碳原子。虽然碳原子损失假说已经被证明，但碳原子损失的具体过程目前还不清楚。研究者们提出了很多假说，但是目前只有一个假说得到了一定程度的验证。在这个假说中，C-C键的断裂是由一种产生中间产物醛的脱羰反应(损失1个CO分子)引起，因此烷烃合成途径经常被称为脱羰途径。

研究者们发现一些拟南芥突变体蜡质成分中烷烃和醛的含量存在着一定的相关性。其中最明显的是拟南芥CER1和CER22突变体，这2个突变体茎表皮蜡质中烷烃含量减少，醛的含量上升。研究者们推测CER1和CER22编码可以催化醛脱羰反应的酶。但是，在拟南芥中出现这种烷烃和醛之间的相关性，也可能是由于醛是烷烃途径的支路产品，烷烃合成被破坏后，合成醛的支路活性提高，从而导致醛含量的上升。

因此，仅仅根据突变体的表型还无法判断CERl和CER22是否编码与烷烃合成相关的脱羰基酶。虽然研究者们已经克隆出了拟南芥CERl基因，但是该基因编码的酶的功能目前还不清楚。总之，目前还没有足够的证据支持脱羰作用假说，因此，烷烃合成途径是蜡质生物合成途径中了解最少的一部分。

在拟南芥叶片中，烷烃是烷烃途径的最终产物，但是在拟南芥茎中和甘蓝叶中，烷烃通常伴随着相应的二级醇和酮出现，这说明烷烃途径还包括其他的反应。最近，研究者们用反向遗传学的方法在拟南芥茎中发现了一个与二级醇和酮合成相关的细胞色素P450依赖性酶(CYP96A15)。这种酶被称为中链烷烃羟化酶(midchain alkane hydroxylase, MAHl)，它可以参与催化2个反应步骤，第1个反应是烷烃中间的-CH2-基团的羟基化形成二级醇，第2步反应是二级醇进一步氧化为酮。在以烷烃为主要中间体的反应途径中，烷烃是否进一步氧化，取决于植物的种类和器官的类型。

2 蜡质成分运输机制

在目前研究的所有植物中，催化蜡质合成前体VLCFAs形成的酶都定位在内质网上。这说明植物从VLCFAs的形成到最终的蜡质成分合成的整个过程都是在细胞内的内质网中完成，最终合成的蜡质产物必须从细胞内质网中运输到质膜再穿过细胞壁运输到植物表皮。

2.1 蜡质成分从内质网运输到质膜

目前，研究者提出了2个关于蜡质成分从内质网到质膜运输机制的假说。第1个假说是泡蘘分泌和高尔基体介导的运输机制，即蜡质通过泡蘘从内质网中运输到高尔基体，然后再运输到原生质膜；第2个是蜡质成分通过内质网和质膜接触部位直接运输的途径。

目前有一些实验结果支持第1种假说。比如，高粱和水稻的表皮细胞中都含有暗染色的泡蘘。但是，对水稻进行的细胞化学试验表明这些被测试的嗜锇颗粒对角质和蜡质合成的候选蛋白的反应呈阴性。因此，泡蘘在蜡质成分从内质网到质膜中的运输中所起的作用，目前还不清楚。

第2个假说认为蜡质成分可以不通过蘘泡直接从内质网和质膜接触的地方运输，这种接触指的是2种膜靠的非常近，而不是互相融为一体。目前，研究者们已经发现了植物细胞中内质网和质膜的接触部位，在这个部位内质网和质膜非常接近，距离在10nm之内，这个部位被称作质膜连接膜(PM-associated membranes，PAMs)。目前，研究者们已经鉴定了PAMs的形态结构，并且分析了PAMs的化学组成，结果表明这个区域富含脂质生物合成蛋白。研究者们推测，这一区域富含脂质载体蛋白，从而行使脂质转运的功能。

2.2 蜡质成分向质膜外转运的机制

蜡质成分运输到质膜之后，必须从脂质双分子层释放出来进入质外体环境中。最近，研究者们在拟南芥茎中发现了2个与上述蜡质运输过程相关的转运蛋白CER5和WBC1l。这2个蛋白是ATP结合盒式(ATP binding cassette，ABC)转运蛋白，属于ABCG/WBC亚家族。CER5和WBC11和植物表皮蜡质运输有关，因为拟南芥CER5和WBC11突变体表皮蜡质含量减少，细胞内蜡质含量增加。

虽然从CER5和WBC11突变体的表型来看，质膜上蜡质的运输需要CER5和WBC11这2个ABC转运蛋白的参与，但是现在还没有直接的证据证明这2个转运蛋白的底物是蜡质分子。不过，CER5和WBC11的蛋白序列和已知的人类ABCG亚家族脂质转运蛋白很相似，因此，CER5和WBC11转运的底物很可能是蜡质分子。

拟南芥CER5WB11双突变体茎上的蜡质成分损失量和单突变体相似，说明这2个转运蛋白存在于同一途径或同一个复合体中。属于WBC亚家族的ABC转运蛋白是一种半转运蛋白，它需要通过二聚化作用形成完整的转运蛋白来行使功能。因此有研究者认为CER5和WBC11可以形成异质二聚体，从而将蜡质成分运输出表皮细胞质膜。但是，拟南芥CER5WBC11双突变体茎上仍然有一些蜡质成分积累，说明还有其他的转运蛋白参与了蜡质成分跨膜运输的过程。

2.3 蜡质成分穿越细胞壁到表皮角质层的运输机制

一旦蜡质成分从细胞质膜中转运出来之后，就必须穿过亲水的细胞壁到达表皮细胞角质层。脂转运蛋白(lipid transfer proteins，LTPs)在植物表皮中大量表达，可以分泌到质外体，体积很小，可以穿过细胞壁上的孔隙，具有可以结合长链脂肪酸的疏水袋，因此，研究者们认为LTPs可能在蜡质成分的跨壁转运起主要作用。但是目前还没有直接的试验证据支持这一假说。这一方面是因为在植物体内验证LTPs的功能很困难，另一方面是因为编码LTPs的候选基因太多，在拟南芥基因组中就有72个可能编码LTPs的候选基因。最近，研究者们发现拟南芥ITPG突变体表皮蜡质成分中的烷烃含量大幅下降，并且从该突变体中鉴定出的LTPG基因编码一种糖基化磷脂酰肌醇结合型的LTP蛋白LTPG，目前，有研究表明LTPG定位在质膜上，具有结合脂质分子的能力，是脂质转运所必需的一种蛋白。但是，LTPG是否具有穿越细胞壁将脂质运输到表皮的功能尚有待验证。

3 蜡质生物合成调节机制

目前有研究表明，植物表皮蜡质的合成会受到植物生长发育和环境因子的影响。例如，在快速生长的拟南芥茎上，茎表皮蜡质含量会随着茎表面积的增加而增加。在不同的发育阶段，拟南芥CER2和CER6基因的表达水平也不同。其中，CER6还可以被光照和渗透胁迫等可以促进蜡质积累的环境因子诱导表达。虽然已经有确凿的证据表明植物蜡质合成可以在转录水平上被调控，但是调控植物蜡质合成的转录因子目前还没有被完全鉴定出来。

拟南芥W1N1/SHNl基因是一种与表皮蜡质积累有关的转录因子。在WIN1超量表达时，拟南芥叶和茎中蜡质含量都有很大程度的增加，同时还检测到蜡质合成相关基因如KCS1等的表达水平也有所增强，这表明W1N1/SHN1是蜡质合成基因转录激活因子。Kannaangara等的研究表明虽然W1N1/SHNl转录因子可以激活角质和蜡质生物合成基因。但是，WIN1/SHNl很可能不是直接激活这些基因，而是通过调控其他转录因子的表达来间接激活角质和蜡质生物合成基因。

Raffaele等利用微阵列技术和遗传学的方法，在拟南芥中发现MYB30基因参与了脂质生物合成途径以及从脂肪酸到超长链脂肪酸的延伸途径的某一特定步骤。瞬时表达实验证实，MYB30是一些基因的转录激活因子，这些基因编码形成脂肪酸延伸酶复合物的4种酶。

据报道拟南芥突变体CER2的茎比野生型亮绿，说明突变体的表皮蜡质晶体比野生型含量低，主要是醛、烷烃、仲醇和酮的减少，相反，脂肪酸的量却增加了，而伯醇的含量却几乎没有变化，另外，这些成分的链长都比野生型的要少2～4个碳原子，因此认为CER2的突变作用阻断了超长链脂肪酸延伸作用的最后2个步骤。这种阻断使所有的脂肪酸及其衍生物的链长变短了。CER2蛋白与参与脂肪酸生物合成的任何酶都没有相似性，因此认为CER2基因产物可能是延伸酶的调节因子。

Kamigaki等研究表明，PEX10(过氧化物酶体生物起源因子)基因在维护内质网的形态和调控CER1、CER4、WAX2和SHNl基因的表达上起着至关重要的作用，因此它可能编码一种调控表皮蜡质的生物合成的转录因子。

最近在拟南芥中又发现一种新的控制表皮蜡质积累的调节途径，这条途径中的关键成分是CER7核糖核酸酶，CEP(7是外来体的核心亚基。外来体是一种在进化上非常保守的蛋白复合体，在RNA的加工和降解过程中起到3′-5′外切核糖核酸酶的作用。除了行使普通的外来体功能之外，CER7还具有控制表皮蜡质合成的特殊功能。在表皮细胞中CER7核糖核酸酶的作用是降解编码蜡质合成关键基因CER3转录抑制因子的mRNA，从而使表皮细胞中的CER3蛋白正常表达，最终促进蜡质成分合成。目前，需要进一步进行的工作是鉴定CER7核糖核酸酶的目标mRNA和CER7调控机制的具体机制。

4 问题与展望

植物表皮蜡质的生物合成和转运途径是一个复杂的、由各种酶和转运蛋白组成的网络。目前，采用分子遗传学的方法已经成功的鉴定了该网络中许多酶和转运蛋白的功能，确定了内质网是细胞内蜡质成分合成的主要部位，并且鉴定出了和蜡质成分穿越质膜向质外体运输相关的蛋白。现在，需要解决的主要问题是植物蜡质成分中烷烃的合成机理、蜡质成分从内质网向质膜运输的机制、ABCG蛋白调节的蜡质运输机制、蜡质成分穿越细胞壁运输到植物表皮的机制和植物生长发育及外界环境因子对表皮蜡质合成的影响。

随着分子生物学和遗传学的不断发展，各种新的研究方法不断出现，现在RNA干涉、酵母双杂交、基因芯片等新技术已经广泛用于植物蜡质合成和转运途径的研究，为进一步阐明植物蜡质合成和转运机理打下了坚实的基础。

注明：国家自然科学基金项目（31160384）