摘　要: 以对霜霉病具有抗性的葡萄品种‘左优红’和‘Fredonia’、委陵菜、无花果为试材,制备丙酮和2种乙醇提取物,研究4种植物的不同提取物在感病葡萄品种‘霞多丽’抵御霜霉病侵染中的作用,观测其对‘霞多丽’葡萄叶片多酚氧化酶（PPO）和β-1,3葡聚糖酶（Glu）活性的影响。结果表明：4种植物的提取物100倍稀释液均可在一定程度上降低葡萄霜霉病菌对‘霞多丽’叶片的侵染率,提取物作用效果强弱依次为70%乙醇委陵菜叶片提取物（60℃提取3h）〉50%丙酮的‘Fre-donia’叶片提取物＞70%乙醇的‘左优红’的提取物（50℃水浴提取5h）,而无花果提取物作用最差有效提取物均能不同程度地提高‘霞多丽’葡萄叶片的PPO和Glu活性。

关键词: 葡萄霜霉病叶片提取物多酚氧化酶β-1,3葡聚糖酶

葡萄(Vitis vinifera.I.)是世界范围内广泛种植的果树，在我国国民经济中占重要地位。近年来，随着国民经济的发展和人们生活水平的提高，酿酒葡萄的栽培面积逐年增大，但目前我国的主栽酿酒葡萄品种多属欧亚品种，抗逆性较差，同时随着种植面积的不断扩大，各地之间插条苗木交换日益频繁，葡萄病害日渐严重，其中葡萄霜霉病是危害最大的真菌病害之一。当前葡萄霜霉病的防治主要采用栽培措施和化学防治，栽培措施自身作用存在局限性，化学防治由于农药的高毒性和残留等因素易对环境和人体健康造成危害。据报道，一些植物的有机溶剂提取物具有抑菌作用，能够提高植物的抗病性。如，大青叶和板蓝根叶片的正丁醇和乙醇提取物具有显著广谱抑菌作用；辣椒乙醇提取物对酿酒酵母和黑曲霉等有明显的抑制作用；虎杖提取物Milsana可以诱导植物的防御反应及活性氧的产生，可以降低白粉病对黄瓜叶片的侵染。但植物源抗菌剂的研究与开发刚起步，其在葡萄抗病中的作用及机制的研究还较少。

植物受到病原菌侵染时，启动自身的防御系统，一些防御相关酶被诱导合成，多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)和β-1，3葡聚糖酶(β-1，3-glucanase，Glu)是其中2种重要的防御酶。其中，PPO能够催化术质素单体聚合成木质素，对抗病物质如植保素等的合成也起催化作用；Glu可以水解真菌细胞壁的主要成分之一的葡聚糖，PPO和Glu活性高低与植物抗病性关系密切。因此，该试验拟以对霜霉病具有抗性的葡萄品种‘左优红’和‘Fredonia’以及对霜霉病免疫的植物委陵菜和无花果叶片为试材，测定其丙酮、正丁醇和乙醇提取物对葡萄霜霉病侵染率及葡萄叶片PPO和Glu活性的影响，初步研究4种植物提取物在葡萄抵御霜霉病中的作用及机制，以期为利用生物学手段防治葡萄霜霉病提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1．1 试验材料

葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)，采自青岛农业大学葡萄试验基地‘霞多丽’发病叶片。葡萄感病品种‘霞多丽’、抗病品种。左优红’和‘Fredonia’、无花果种植于青岛农业大学葡萄试验基地。委陵菜由青岛农业

大学辛华老师赠予。

1．2 试验方法

1．2．1 葡萄霜霉病菌的采集与繁殖 从田间感病葡萄品种‘霞多丽’植株采回被霜霉病侵染的叶片，清水冲去旧孢子囊，在20℃、相对湿度100%下培养24 h，待新孢子囊长出后，用毛刷轻轻刷下孢子囊，无菌水配制成孢子囊8×104／mL悬浮液。接种前载玻片萌芽法测定孢子囊生活力，萌芽率85%以上为有效。

1．2．2 叶片提取物的制备 分别取‘左优红’、‘Fredonia’、委陵菜或无花果1 a生枝条上的功能叶片，称鲜重，于烘箱50℃烘至恒重，利用微型植物粉碎机粉碎，过40目筛子。称取0.5g粉碎的叶片，以固液比1:20的比例，分别在50%的丙酮60℃提取3 h、70%乙醇溶液60℃ 提取3 h(70%乙醇提取流程A)或50℃水浴提取5 h(70%乙醇提取流程B)，过滤收集滤液，得到粗提物。

I．2．3 材料处理 取盆栽健康无病的易感葡萄品种‘霞多丽’第3～6叶位叶片，自来水冲洗数次后，叶背向上平摆在10%的琼脂培养基上，分成2组，A组喷施水及不同稀释倍数的4种植物提取物，B组喷施水及有效植物提取物[Ⅰ:70%乙醇(提取流程A)的委陵菜叶片提取物、Ⅱ:50%丙酮的‘Fredonia’叶片提取物、Ⅲ：70%乙醇的‘左优红’的提取物(提取流程B)]。处理后12 h用微量移液器接种8×104个／mL孢子囊悬浮液100 µL，然后置于2O℃培养箱中，保持湿度为90%以上。A组7 d后统计发病率，B组分别于接种后0、l、2、3、4、5、6 d测定PPO和Glu活性。

1．2．4 霜霉病发病率的统计 发病率(%)=(发病叶片数／总叶片数)×100%。

1．2．5 PPO活性测定 PPO活性测定参照朱广廉等的方法，以1g鲜组织1 min产生OD值变化0.01为1个酶活性单位(U)，以PBS代替酶液为对照。

1．2．6 Glu活性测定 按照史益敏等的方法测定β-1，3-葡聚糖酶活性，以1 g鲜组织1 min产生1 g还原糖的酶量为1个酶活性单位(U)。

2 结果与分析

2．1 4种植物提取物对‘霞多丽’葡萄抵御葡萄霜霉病的影响

由表l(表略)可知，用不同溶剂和提取流程获得的‘左优红’提取物都可不同程度地降低葡萄霜霉病菌对‘霞多丽’叶片的侵染，均为稀释100倍的效果最为明显。在4种植物的提取物中，以70%乙醇(提取流程A)的叶片提取物作用最强，稀释100倍的提取物可使‘霞多丽’叶片感病率降低38.8%；其次是50%丙酮的‘Fredonia’叶片提取物，可使‘霞多丽’感病率降低33.3％；然后是70%乙醇的‘左优红’的提取物(提取流程B)，使‘霞多丽’感病率下降29.6%无花果提取物作用最弱。

PPO和Glu是植物体内重要的防御酶，与葡萄抗病性关系密切，因此，该试验进一步研究了70%乙醇(提取流程A)的委陵菜叶片提取物、50%丙酮的‘Fredonia’叶片提取物及70%乙醇的‘左优红’的提取物(提取流程B)对葡萄霜霉病具有较强抑制作用的提取物对感病葡萄品种‘霞多丽’叶片PPO和Glu活性的影响，以期探讨提取物抵御霜霉病的作用机制。

2．2 4种提取物对‘霞多丽’葡萄叶片PPO活性的影响

由图1(图略)可知，正常情况下在测定时间范围内，‘霞多丽’叶片PPO活性随时间延长无显著变化(P0.05)，接种霜霉病菌后‘霞多丽’叶片PPO活性呈先升高后降低的趋势，于处理3 d时达最大值(P0.05)；70%乙醇(提取流程A)的委陵菜叶片提取物、50%丙酮的‘Fredonia’叶片提取物及70%乙醇的‘左优红’的提取物(提取流程B)预处理后接种霜霉病菌的‘霞多丽’叶片其PPO活性升高迅速，于接种霜霉病菌2 d时达最大值，并且DPO活性升高幅度显著大于单独接种霜霉病菌的‘霞多丽’叶片(P0.05)，以对霜霉病抑制效果最好的70%乙醇(提取流程A)的委陵菜叶片提取物对PPO活性的诱导作用最强(P0.05)。

2．3 4种提取物对‘霞多丽’葡萄叶片Glu活性的影响

由图2(图略)可知，正常条件下‘霞多丽’叶片Glu活性随时问延长无显著变化，受到霜霉病菌侵染后Glu活性呈先升高后降低的趋势，于处理3 d时Glu活性达最高值(P0.05)。70%乙醇(提取流程A)的委陵菜叶片提取物、50%丙酮的‘Fredonia’叶片提取物及70%乙醇的‘左优红’的提取物(提取流程B)预处理诱导霜霉病侵染的‘霞多丽’叶片Glu活性明显增强，且变化快(P0.05)，于接种霜霉病菌2 d时Glu活性达最大值，其中委陵菜叶片提取物对Glu活性的诱导作用最强。

3 讨论与结论

葡萄霜霉病是世界范围内严重影响葡萄产业的真菌病害，研究葡萄对霜霉病的抗性及机制具有重要理论和实践意义。已有研究表明，一些植物材料的提取物对细菌和真菌具有一定抑制作用，如，黄易安等研究认为，乙酸乙酯萃取的蛇含委陵菜提取物具有良好的抑菌作用，特别对金黄色葡萄球菌的抑制效果最佳；杨海霞等研究发现，无花果叶片乙醇提取物具有明显的抑菌作用；但是目前尚未见有关植物提取物在葡萄抵御霜霉病中的作用的报道。该试验选用对霜霉病具有较强抗性的2个葡萄品种‘左优红’和‘Fredonia’以及对霜霉病免疫的植物委陵菜和无花果4种植物为试材，研究其不同有机溶剂提取物在葡萄抵御霜霉病中的作用。结果表明，4种植物不同溶剂提取物的100倍稀释液都能降低霜霉病菌对感病葡萄品种‘霞多丽’叶片的侵染率，但不同植物的不同溶剂提取物作用强弱存在差异，推测与提取物中有效成分的种类、性质和含量有关。有报道表明，不同的提取物提取的成分不同，陈国刚等研究表明，单宁的最佳提取物为丙酮和水的混合物，而70%的乙醇可提取石榴皮黄酮类物质。Batovska等认为，丙酮可以提取叶片表面物质而丁醇可以提取细胞内物质。葡萄科植物含有大量抗微生物活性的化学成分，如黄酮类、帖类、酚酸类、生物碱、甾醇类、挥发油及芳香化合物等；Batovska等研究认为，保加利亚葡萄叶片软脂酸和单羟基羧酸含量与葡萄对霜霉病的抗性密切相关，棕榈酸的含量增加时，抗性增强。‘左优红’和‘Fredonia’以及委陵菜和无花果4种植物中具有抑菌作用的成分需利用质谱分析等技术进一步分离鉴定，最适提取溶质的种类和浓度也需进一步确证。

目前有关植物提取物抑菌作用的研究较多，但对提取物作用机制的研究尚不多见，证明超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，P0D)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia—lyase，PAL)、PPO和POD活性与诱导抗性有关。陈红兵等发现，万寿菊根的提取物能诱导西瓜保护酶如SOD和POD活性提高，减轻西瓜枯萎病菌粗毒素对西瓜幼苗的毒害作用；香樟叶石油醚提取物能显著提高草莓果实PAL、PPO和POD的活性，增强果实自身的抗真菌病的能力。Glu是防御反应中一种重要的细胞壁水解酶，一方面能破坏真菌细胞壁而杀死病原菌，一方面起到从真菌细胞壁释放葡聚糖的作用，而这些物质则作为激发子被植物细胞识别而激发植物防卫基因表达，从而产生抗病反应。从褐藻(Laminaria digitata)中分离的海藻多糖可以诱导霜霉病菌侵染的葡萄细胞胞质碱化，发生氧化爆发，几丁质酶和Glu活性增强，降低霜霉病菌对植株的侵染率 。有报道称，PPO催化木质素单体聚合成木质素，且对抗病物质如植保素等的合成也起催化作用，活性的提高可作为植物抗病性增强的标志。试验进一步研究了70%乙醇(提取流程A)的委陵菜叶片提取物、50%丙酮的‘Fredonia’叶片提取物及70%乙醇的‘左优红’的提取物(提取流程B)对葡萄霜霉病具有较强抑制作用的提取物预处理对受霜霉病菌侵染的‘霞多丽’叶片PPO和Glu活性的影响，以初步探究其抑菌机制。结果表明，霜霉病菌侵染诱导‘霞多丽’叶片PPO和Glu活性显著升高(图1、2略)，3种提取物预处理后接种霜霉病菌的‘霞多丽’叶片PPO和Glu活性进一步迅速升高，PPO和Glu活性峰值高且出现得早，并以70％乙醇(提取流程A)的委陵菜叶片提取物对PPO和Glu的诱导作用最强，这与感病率结果基本一致，推测几种植物提取物提高葡萄抗霜霉病的作用与其诱导葡萄PP()和Glu活性增强有关。

植物受到病原菌侵染时可通过增加木质素含量、合成植保素、活性氧爆发等多种机制增强对病原菌的抵抗能力，‘左优红’、‘Fredonia’、委陵菜和无花果4种植物的不同提取物对葡萄其它抗病机制是否存在激发作用也需进一步深入研究。此外，目前人们关于植物提取物的抑菌活性研究已有不少报道，但尚未探明其作用机制，更未应用于果树病害防治中，还需要植物保护、植物化学和植物分子生物学等多学科的合作，以期实现新的植物源杀菌剂的研制与开发。

参考文献(略)

基金资助: 农业部“948”资助项目（2006-G26） 青岛市自然科学基金资助项目（10-3-4-5-5-jch）