根据《兽药管理条例》和《兽药注册办法》规定，我部组织制定了口蹄疫灭活疫苗内毒素和总蛋白测定法，现予发布，自发布之日起执行。

　　特此公告。

　　附件：1.口蹄疫灭活疫苗内毒素测定法

　　2.口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　农业部

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　2014年3月12日

　　附件1

口蹄疫灭活疫苗内毒素测定法

　　吸取12 ml疫苗放入15 ml离心管中，置50±5℃水浴90分钟，然后在4℃条件下，以15000 g离心10分钟，取水相5.0 ml，按现行《中国兽药典》一部附录进行检验。每头份疫苗中内毒素含量应不高于50 EU。

　　附件2

口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法

　　取1瓶疫苗恢复至室温，在3个1.5ml离心管中分别精确加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混匀，室温放置10分钟，在4℃条件下，以15000g离心15分钟。吸弃液相，沉淀物用400μl丙酮洗涤2次，室温干燥约15分钟，加50μl去离子水复溶后，按附注进行检验。每毫升疫苗总蛋白含量应不高于500μg。

　　附注：口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法

　　1.方法与原理

　　本法适用于口蹄疫病毒油佐剂灭活疫苗总蛋白含量检测。本法系福林酚法(lowry法)，依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cμ2+螯合形成蛋白质－铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

　　2.试剂与仪器

　　2.1试剂丙酮（分析纯）、无菌去离子水、商品化Lowry法改良试剂盒；

　　2.2设备酶标仪（全波长），“Μ”型96孔板，卡介苗注射器，单通道和多通道移液器，涡旋震荡仪，酶标板振荡器等。

　　3.操作步骤

　　3.1标准系列稀释液制备将商品化试剂盒内标准牛血清白蛋白（2mg/ml母液），按下表依次稀释。

编号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

母液（μl）

0

5

25

50

100

150

200

300

400

去离子水（μl）

400

395

375

350

300

250

200

100

0

终浓度（μg/ml）

0

25

125

250

500

750

1000

1500

2000

　　3.2检验疫苗处理取1瓶疫苗恢复至室温摇匀后，在3个1.5 ml离心管中分别精确加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混匀，室温放置10分钟，在4℃条件下，以15000 g离心15分钟。吸弃液相，沉淀物用400μl丙酮洗涤2次，室温干燥约15分钟，加50μl去离子水复溶备用。

　　3.3反应板加样与读数

　　3.3.1各取3.1稀释的各浓度牛血清白蛋白标准溶液40μl，以及三重复待检疫苗样品40μl，分别加入到96孔板内。用排枪迅速加入200μl改良lowry法试剂盒内试剂，立即用振荡器混匀30秒；

　　3.3.2封膜，室温孵育10分钟；

　　3.3.3各孔内分别加入20μl 1倍酚试剂（试剂盒内为2倍，用前用去离子水现稀释），立即用振荡器混匀30秒；

　　3.3.4封膜，室温孵育30分钟；

　　3.3.5酶标仪测定750nm吸光值，保存读数。

　　3.4数据处理

　　根据系列标准蛋白稀释液的浓度（0μg/ml～2000μg/ml）和750nm吸光值，使用EXCEL以吸光值为X轴，以蛋白标准浓度为Y轴，绘制标准曲线，依据趋势线求得多项式，其多项式R2≥0.98。

　　将被检样品的吸光值代入标准蛋白获得的多项式，计算样品中蛋白含量，根据取样量求得1ml样品中蛋白含量。例如口蹄疫灭活疫苗水相/油相比例为1:1，免疫剂量为2ml时，100μl疫苗经丙酮沉淀后用50μl去离子水复溶，测得浓度即为每头份疫苗中蛋白浓度，或2ml疫苗中蛋白浓度。结果判定时，将测定值除以2即得每毫升疫苗中总蛋白含量。

　　3.5结果判定

　　若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量小于或等于500μg，则判定被检疫苗总蛋白含量符合规定；若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量大于500μg，判定被检疫苗总蛋白含量不符合规定。

　　3.6检测数据处理举例

　　3.6.1收集数据如表所示

Value

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

0.102

0.149

0.336

0.504

0.836

1.122

1.334

1.702

1.923

--

--

--

B

0.677

1.722

0.252

1.116

2.167

1.020

--

--

--

--

--

--

C

0.640

1.704

0.230

1.050

2.195

0.962

--

--

--

--

--

--

D

0.641

1.716

0.225

1.061

2.175

1.012

--

--

--

--

--

--

E

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

F

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

G

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

H

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

　　上述表格中，A1-A9为系列稀释的标准牛血清白蛋白溶液，A1至A9蛋白浓度依次增高；B、C、D行中1-6列为检测样品750nm吸光值，B1-B6为6批不同批次疫苗样品，每一列为同一疫苗样品三个重复。

　　3.6.2绘制标准曲线：将上表中数据复制到EXCELL表格中，

Value

1

2

3

4

5

6

7

8

9

OD750

0.102

0.149

0.336

0.504

0.836

1.122

1.334

1.702

1.923

蛋白浓度μg/ml

0

25

125

250

500

750

1000

1500

2000

　　采用EXCEL程序，选中1-9列对应的两行数据→“插入”→“散点图”，选择“带平滑线和数据标记的散点图”，得到以750nm吸光值为X轴，以蛋白浓度为Y轴的曲线图。选择“图表工具”中“布局”→ “趋势线”→“其他趋势线选项”，选中“多项式”、“显示公式”和“显示R平方值”。通常R平方值大于等于0.98表明标准曲线可信。每一块96孔板应设一组标准并绘制相应标准曲线。

　　3.6.3数值计算

　　以样品测定OD750值为X，代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423，Y为蛋白浓度，以表中第一批疫苗测定结果为例。该疫苗三重复测定的OD750数据（X）分别为：0.677、0.640、0.641，代入公式计算蛋白含量（Y）分别为：334μg/ml、306μg/ml、307μg/ml，该数据为每毫升水相抗原中总蛋白含量。计算三重复数值的平均值（AVERAGE）为316μg/ml，标准差（STDEV.P）为13.1，变异系数为4.15%（标准差/平均值*100%），将每毫升水相抗原中总蛋白含量，除以2折算为每毫升疫苗总蛋白含量，该疫苗的总蛋白含量为138μg/ml。按照上述方法，可计算其他样品的总蛋白含量。

　　3.6.4结果判定

　　同一样品不同重复间变异系数应小于5.3%，否则试验不成立，应重做。若测定值小于或等于500μg/ml，则判定被检疫苗总蛋白含量符合规定；若测定值大于500μg/ml，则判定被检疫苗总蛋白含量不符合规定。